脐血干细胞移植修复失代偿期肝硬化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

脐血干细胞：脐血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐血中含有可重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。

四氯化碳花生油诱导大鼠失代偿期肝硬化：四氯化碳(CCl₄)是使用最早、最广泛的肝纤维化诱导剂，CCl₄作用于肝线粒体，经过代谢生成毒代谢物，破坏生物膜结构，造成肝脂肪变性与坏死，符合肝损伤发展成肝硬化的过程。动物实验研究显示，联合应用CCl₄和乙醇可明显缩短诱导大鼠肝硬化模型的时间。

背景：国内外研究证实，脐血干细胞可在体内大量扩增、诱导分化成完备的肝细胞，并表现出一定的肝功能。

目的：观察脐血干细胞移植治疗大鼠失代偿期肝硬化的效果。

方法：取20只SD大鼠，以40%四氯化碳花生油诱导大鼠失代偿期肝硬化模型，造模后第8周随机分为对照组与实验组，每组10只，实验组于尾静脉注射1.0×10⁷ L^-¹的人脐血干细胞悬浮液2 mL，对照组于尾静脉注射细胞培养液2 mL。移植4周后，检测大鼠血清学天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、总胆红素、透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅳ水平，肝脏组织病理切片结果。

结果与结论：①血清学检测结果：与对照组比较，实验组白蛋白水平增高(P < 0.05)，天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅳ水平降低 (P < 0.05)。②肝脏病理组织学观察结果：两组肝脏组织均有不同程度的肝硬化，实验组肝硬化程度低于对照组。③结果表明，脐血干细胞移植可有效改善失代偿期肝硬化大鼠的肝组织生理功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3740-4637(郭宪立)

关键词: 干细胞, 移植, 肝硬化, 肝纤维, 干细胞移植, 人脐血, 脐血干细胞, 大鼠, 失代偿期肝硬化, 白蛋白, 总胆红素, 转氨酶

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord blood stem cells can be differentiated into functional liver cells in vivo, instead of mature liver cells in the treatment of liver diseases.

OBJECTIVE: To observe the effect of umbilical cord blood stem cell transplantation on decompensated cirrhosis in rats.

METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats were enrolled and given 40% carbon tetrachloride peanut oil to make decompensated cirrhosis models. Eight weeks after modeling, model rats were randomized into control and experimental groups (n=10 per group), and subjected to injection of umbilical cord blood stem cell suspension (2 mL, 1.0×10⁷/L) or cell culture medium (2 mL) via the tail vein, respectively. At 4 weeks after injection, levels of serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, albumin, total bilirubin, hyaluronic acid, laminin, procollagen III and type IV collagen were detected; rat liver tissues were sliced for pathological observation.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the albumin level was significantly increased but the levels of serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, total bilirubin, hyaluronic acid, laminin, procollagen III and type IV collagen decreased significantly in the experimental group (P < 0.05). From the pathological view, severity of liver cirrhosis was lower in the experimental group than the control group. Therefore, umbilical cord blood stem cell transplantation can effectively restore the liver function of decompensated cirrhosis in rats.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Cord Blood Stem Cell Transplantation, Liver Cirrhosis, Tissue Engineering

郭宪立，刘跃，周丽敏，胡玥. 脐血干细胞移植修复失代偿期肝硬化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2080-2085.

Guo Xian-li, Liu Yue, Zhou Li-min, Hu Yu. Umbilical cord blood stem cell transplantation for treatment of decompensated cirrhosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2080-2085.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 20只失代偿期肝硬化SD大鼠全部进入结果分析，无脱失。

2.2 大鼠一般状况观察与肝脏组织标本观察结果正常对照大鼠肝脏表面光滑、红润，肝脏质地柔软，肝小叶结构清晰，叶边缘锐利，肝窦无扩张，见图1。与正常对照组大鼠肝脏比，模型组大鼠肝脏缩小，表面呈棕褐色，弥漫有大小不等结节，直径为0.2-0.5 cm，肝脏质地变硬，叶边缘变钝且呈现波浪形；肝脏组织病理检测清晰可见肝细胞疏松、浊肿，结构消失，细胞核碎裂、消失，出现大量脂肪空泡，有多个大小不等的假小叶形成，符合肝硬化诊断标准，见图2。

2.3 脐血干细胞的形态及流式细胞仪检测结果刚分离的脐血干细胞呈现为圆形，细胞体透亮，活细胞率达到95%以上。流式细胞仪检测显示，CD34造血细胞表达比例约为9.6%。

2.4 两组大鼠肝细胞功能检测结果与对照组相比，实验组血清白蛋白水平显著增高(P < 0.05)，丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基、总胆红素水平显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.5 两组大鼠肝纤维化检测结果实验组血清明质酸、层粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ、前胶原蛋白Ⅲ水平均明显低于对照组(P < 0.05)，见表2。

2.6 两组大鼠肝脏组织病理学检测结果实验组大鼠肝脏组织肝细胞结构完整，细胞肿胀，细胞核有少量溶解，可见少量脂肪空泡，中度纤维化，Masson染色显示“假小叶”的纤维间隔纤细，见图3A，B；对照组大鼠肝脏组织肝细胞肿胀，细胞核大部分溶解、消失，现大量脂肪空泡，中、重度纤维化，Masson染色显示“假小叶”的纤维间隔粗厚，见图3C，D。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年2至7月在河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料

脐血来源：封闭式采血法采集河北医科大学第二医院妇产科健康、正常足月分娩胎儿的脐血，由河北医科大学第二医院产科协助完成，均已征得产妇及家属授权同意和医院伦理委员会批准。

实验动物：健康SPF级10周龄雄性SD大鼠30只，体质量(200±30) g，由河北省实验动物中心提供，于温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%适应饲养1周。

脐血干细胞移植修复失代偿期肝硬化实验用主要试剂及设备：
试剂及设备	来源
KDC-2046低速冷冻离心机	杭州汇尔仪器设备有限公司
BPH-9042 CO₂恒温细胞培养箱	上海一恒
MF51荧光倒置相差显微镜	广州市明美光电技术有限公司
TM-XB20J型台式蒸汽灭菌器	滨江医疗
BD FACSCalibur流式细胞仪	美国
Dulbecco,s modified Eagle,s medium (DMEM)	GIBCO，美国
抗CD34、CD45	北京中山生物技术有限公司
体积分数10%胎牛血清	杭州四季清
四氯化碳(CCl₄)	成都化工厂
花生油	鲁花5S压榨一级花生油
磷酸盐缓冲液	实验室配制
DAB显色试剂盒	北京中衫金桥公司

1.4 实验方法

失代偿期肝硬化大鼠模型制备：将30只SD大鼠随机分为2组，正常对照组(n=5)和模型组(n=25)。模型组大鼠按3 mL/kg腹腔皮下注射40%四氯化碳花生油，每周2次(周二、周六)，持续注射8周，同时以含体积分数15%乙醇的水为饮用水，用普通大鼠饲料喂养；正常对照组给予普通饲料和普通饮用水，与模型组大鼠同环境下喂养。记录所有大鼠的一般情况、死亡率、饮食变化等。于第8周随机取正常对照组及模型组大鼠各5只，麻醉后，观察大鼠肝脏变化及肝脏病理学检查，了解大鼠造模情况。

实验分组及干预：将20只失代偿期肝硬化大鼠随机分为2组，对照组和实验组，10只/组。实验组大鼠从尾静脉移植含有数量约1.0×10⁷ L^-¹的脐血干细胞悬浮液 2 mL，对照组则经大鼠尾静脉注射2 mL细胞培养液。

脐血干细胞的分离：取30 mL脐血，置于50 mL EP离心管(带盖)中，再精密加入HES 10 mL，振摇混匀，静置1 h；取上层液体20 mL，置于50 mL EP离心管中，加入20 mL磷酸盐缓冲液，振摇混匀，以2 000 r/min低温离心20 min；弃去上清液，再加入溶血素50 mL，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，培养箱(37 ℃、体积分数5%CO₂)中培养5 min；取出，以2 000 r/min低温离心 5 min，弃去上清液，加入30 mL磷酸盐缓冲液洗涤，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，以2 000 r/min低温离心5 min，弃去上清液，再加已加入含体积分数2%-5%血清的DMEM培养基10 mL，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，立即经大鼠尾静脉移植。

脐血干细胞计数及活细胞率测定：取脐血干细胞悬浮液，用DMEM培养基稀释5倍，玻璃吸管慢慢吹打细胞悬浮液，使干细胞均匀悬浮于细胞培养液中；取干净盖玻片盖于计数板上，吸取细胞悬浮液少量，由盖玻片边缘轻轻加入，盖玻片下不能有气泡带入或产生，依靠毛细吸管原理让干细胞悬浮液缓慢填充满整个盖玻片与计数板间，不能让干细胞悬浮液流入旁边槽中，静置4 min。对计数器4个角的4个方格进行干细胞计数，计数压线干细胞原则为计左不计右、计上不计下；合计出4个角的干细胞的数目，按以下公式计算：

4个大方格细胞总数

细胞数= ×10⁴×稀释的倍数

用移液枪精密取100 μL干细胞悬浮液置于0.5 mL EP离心管中，用移液枪精密加入0.4%的锥虫蓝蓝溶液，混合均匀，室温放置3 min。吸取适量染色后的干细胞悬浮液，轻轻滴加到血细胞计数板上，计数未着色活干细胞和着色死干细胞，用以下公式计算干细胞活力，并根据稀释体种算出存活细胞的数量。

细胞总数-着色细胞

细胞总数

干细胞活力(%)= ×100%

流式细胞仪检测：取适量脐血干细胞悬浮液分别装入流式检测管中，分别依次加入CD34-FE、CD35-FE流式抗体，混合均匀，遮光室温放置25 min，使充分反应；分别精密加入0.5 mL红细胞裂解溶液，遮光室温放置15 min；再分别加入0.5 mL磷酸盐缓冲液，室温静置5 min，以1 000 r/min低温离心10 min，除去上清液，再用磷酸盐缓冲液润洗沉淀3次，最后用1 mL磷酸盐缓冲液把细胞制成悬浮溶液，用流式细胞仪进行检测。

1.5 主要观察指标给予普通饲料正常喂养4周，乙醚麻醉，采取颈椎脱臼法处死所有大鼠，检测血清学天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、白蛋白及总胆红素、透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白IV水平；解剖，检查大鼠腹腔，切取整个肝脏，观察肝脏整体情况，用生理盐水冲洗，剪取部分肝组织作病理检验，用体积分数10%中性甲醛溶液固定肝脏组织标本，专业药理技术人员协助对大鼠肝脏组织进行石蜡包埋，切片，常规苏木精-伊红染色和Masson三色染色，利用光学显微镜观察各组大鼠标本肝细胞的坏死、肝脂肪变性及“假小叶”形成情况^[26]。

1.6 统计学分析实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较釆用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞移植是治疗肝功能衰竭的一个新的研究方向^[25-29]。脐血干细胞可在特定环境下诱导为肝样细胞，移植体内后可发挥正常肝细胞的功能，临床上脐血干细胞取材广泛，可在体外分离培养扩增获取大量移植所需要的干细胞^[30]。本实验中分离得到的人脐血干细胞呈现为圆形，细胞体透亮，活细胞率达到95%以上；流式细胞仪检测显示，CD34造血细胞表达比例约为9.6%，可以满足本实验移植的要求。

四氯化碳(CCl₄)是使用最早、最广泛的肝纤维化诱导剂，CCl₄作用于肝线粒体，经过代谢生成毒代谢物，破坏生物膜结构，造成肝脂肪变性与坏死，符合肝损伤发展成肝硬化的过程。动物实验显示，联合应用CCl₄和乙醇可明显缩短诱导大鼠肝硬化模型的时间。作者此次实验采用多次腹腔注射四氯化碳，诱导肝纤维化的发生，诱导8周模型大鼠的肝纤维化及肝功能指标均显示异常，正常SD大鼠肝脏表面光滑、红润，肝脏质地柔软、肝小叶结构清晰、叶边缘锐利，肝窦无扩张。与正常对照组大鼠肝脏比，模型组SD大鼠肝脏缩小，表面呈棕褐色、弥漫有大小不等结节，且肝脏质地变硬、叶边缘变钝且呈现波浪形；同时模型组大鼠肝脏组织病理检测清晰可见肝细胞疏松、浊肿，结构消失，细胞核碎裂、消失，出现大量脂肪空泡，有多个大小不等的假小叶形成。分组时采取随机性原则，组间SD大鼠之间比较无统计学差异。实验结束，血液指标检测及病理切片检验发现所有大鼠均有不同程度的肝硬化，与对照组比，实验组肝硬化程度低于对照组，可以证明这种方法可诱导稳定、持久的动物模型。

实验结果发现，脐血干细胞移植后4周，与对照组相比，实验组大鼠血清白蛋白水平显著增高(P < 0.05)，丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基活性均显著降低(P< 0.05)，总胆红素水平显著降低(P < 0.05)，透明质酸、层粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ、前胶原蛋白Ⅲ水平均明显降低(P < 0.05)。实验提示，脐血干细胞移植后，实验组的肝硬化程度低于对照组。

研究证明，干细胞在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力。实验是采用含40%CCl₄花生油建立失代偿期肝硬化大鼠模型，经SD大鼠尾静脉移植脐血肝细胞，研究人脐血干细胞移植对肝硬化SD大鼠的治疗效果，实验结果提示脐血干细胞可有效改善失代偿期肝硬化大鼠的生理功能，提高SD大鼠生活状态及体能指标，为后续的研究可提供一定的参考价值。实验仅为初步探索性研究，对于人脐血干细胞在肝脏内是如何定植分布、增殖分化及如何表达功能等问题，希望在未来对这些问题做进一步的深入探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程